الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید

از ویکی‌پدیا، دانشنامهٔ آزاد
پرش به ناوبری پرش به جستجو

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (به انگلیسی Polyacrylamide gel electrophoresis PAGE) تکنیکی است که به طور گسترده در بیوشیمی، پزشکی قانونی، ژنتیک، بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی به منظور جداسازی ماکرومولکول‌هایی همچون پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک مورد استفاده قرار می‌گیرد. جداسازی ماکرومولکول‌ها بر اساس حرکت اللکتروفورتیک آنها انجام می‌گردد. میزان این حرکت به طول، کونفورماسیون و بار مولکول بستگی دارد.

برخی مواقع ما از طریق این تکنیک ساختار طبیعی ماکرومولکول‌ها را بررسی می‌کنیم (Native PAGE). گاهی نیز به آن مواد شیمیایی دناتوره کنند ه می‌افزاییم تا درهم پیچیدگی‌ها و ساختار طبیعی از بین برود و مولکول‌ها تنها بر اساس طول و نسبت بارشان از یکدیگر جدا شوند. به این روش SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) گفته می‌شود. در این روش مولکول‌ها بر اساس تفاوت در وزن مولکولیشان از یکدیگر جدا می‌گردند.[۱]

زمانی که این مولکول‌ها در میدان الکتریکی قرار می‌گیرند، رشته‌های پلی پپتیدی که بار منفی دارند، بر اساس میزان بارشان، به سمت آند حرکت می‌کنند. میزان فاصله پیموده شده، با وزن مولکولی آنها نسبت عکس دارد.[۲] با مقایسه نسبت فاصلهٔ طی شده پروتئین به طول ژل(Rf)، می‌توان به وزن مولکولی نسبی پروتئین دست یافت.[۳]

به طور معمول به منظور دناتوره کردن اسیدهای نوکلئیک از اوره استفاده می‌شود. در حالی که به منظور دناتوره کردن پروتئین‌ها عموماً از سدیم دودسیل سولفات(SDS) استفاده می‌گردد.[۴] همچنین ممکن است از ۲-مرکاپتواتانل نیز جهت از بین بردن پیوندهای دی سولفیدی در بین کمپلکس‌های پروتئینی استفاده شود.

روش انجام آزمایش[ویرایش]

آماده‌سازی نمونه[ویرایش]

در مرحله اول لازم است تا نمونه‌ها آماده شوند. نمونه‌ها ممکن است پروتئین یا نوکلئیک اسید باشند و از پروکاریوت، یوکاریوت، بافت، ویروس یا نمونه‌های محیطی گرفته شده باشند یا پروتئین‌های خالص باشند.

اگر نمونه مورد نظر درون بافت یا سلول باشد به منظور دسترسی به نمونه‌ها از روش‌های مکانیکی یا ترکیبی از روش‌های بیوشیمیایی و مکانیکی استفاده می‌گردد. دستگاه‌هایی مانند هموژنایزر، سونیکیتور، سانتریفیوژ و فیلتراسیون در این زمینه کاربرد زیادی دارند. سپس در صورت نیاز نمونه‌ها با یک ماده شیمیایی دناتوره کننده (مانندSDS برای پروتئین‌ها و اوره برای اسیدهای نوکلئیک) ترکیب می‌شوند. با افزودن SDS به پروتئین ساختارهای دوم، سوم و چهارم از بین رفته و پروتئین به شکل پلی پتید خطی در می‌آید. با گرم کردن نمونه‌ها (تا حدود ۶۰ درجه سانتی گراد) دناتوراسیون تسهیل می‌گردد.[۵][۶][۷][۸] همچنین به منظور ردیابی نمونه‌ها در ژل، به آنها رنگ افزوده می‌شود.

آماده‌سازی ژل اکریل آمید[ویرایش]

این ژل دارای اکریل آمید، بیس اکریل آمید، ماده دناتوره کننده (SDS یا اوره) و بافر با pH مشخص است. می‌توان قبل از استفاده از این محلول، با استفاده از فشار منفی آن را بدون گاز کرد تا هنگام پلیمریزه شدن ژل، در آن حبابی ایجاد نشود. همچنین از موادی مانند سولفات آمونیوم و تمد (Temed) که فاقد رادیکال آزاد هستند و نقش تثبیت کنندگی دارند، جهت شروع پلیمریزاسیون استفاده می‌شود.[۹] با اضافه کردن بیس اکریل آمید، بین هر دو اکریل آمید یک کراس لینک(cross link) ایجاد شده و پلیمریزاسیون انجام می‌شود.

ژل معمولاً بین دو صفحه شیشه ای ریخته می‌شود. پس از ریختن ژل به سرعت شانه در بالای آن قرار می‌گیرد تا چاهک‌ها برای وارد کردن نمونه‌ها به داخل ژل ایجاد شود. پس از این که ژل پلیمریزه شد، می‌توان شانه را برداشت.

الکتروفورز[ویرایش]

سیستم‌های بافری مختلفی بر اساس طبیعت نمونه‌ها و هدف از آزمایش در PAGE استفاده می‌شود. بافرهایی که در آند و کاتد مورد استفاده قرار می‌گیرند ممکن است یکسان یا مختلف باشند.[۱۰][۱۱][۱۲]

پس از آماده‌سازی ژل و قرار دادن آن در کاست، نمونه‌ها را بوسیله سرنگ همیلتون وارد چاهک‌ها کرده و منبع انرژی را روشن می‌کنیم. با روشن کردن منبع انرژی میدان الکتریکی ایجاد می‌شود و باعث می‌گردد پروتئین‌ها یا اسیدهای نوکلئیک (که دارای بار منفی هستند) به سمت الکترود مثبت (آند) حرکت کنند.

بر اساس اندازه، هر بیومولکول به میزان متفاوتی در ماتریکس ژلی حرکت می‌کند. مولکول‌های کوچکتر راحت تر از منافذ ژل عبور می‌کنند در حالی که مولکول‌های بزرگتر، به سختی عبور می‌کنند. پس از چند ساعت بیومولکول‌ها بر اساس اندازه‌شان فواصل مختلفی را پیموده‌اند. به گونه ای که مولکول‌های کوچکتر در قسمت‌های پایینی ژل و مولکول‌های بزرگ در قسمت‌های بالاتر قرار می‌گیرند.

پس از اتمام الکتروفورز، ژل رنگ آمیزی می‌گردد. به این منظور معمولاً از رنگ کوماسی بریلیانت بلو R۲۵۰ یا اتورادیوگرافی برای پروتئین‌ها و اتیدیوم بروماید برای اسیدهای نوکلئیک استفاده می‌شود.

پس از رنگ آمیزی، هر پروتئین، به صورت یک باند دیده می‌شود. به منظور این که بتوان وزن مولکولی پروتئین مورد نظر را مشخص کرد از مارکرهای وزن مولکولی استفاده می‌شود.

منابع[ویرایش]

  1. 1- Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee (2010). Fundamental laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. United States: Wiley. pp. 164–179. ISBN: 978-0-470-08766-4.
  2. Kindt, Thomas; Goldsby, Richard; Osborne, Barbara (2007). Kuby Immunology. New York: W.H. Freeman and Company. p. 553. ISBN: 978-1-4292-0211-4.
  3. 3- Kumar, Ajay; Awasthi, Abhishek (2009). Bioseparation Engineering. New Delhi: I.K. international Publishing House. p. 137. ISBN: 978-93-80026-08-4.
  4. 4- Ninfa, Alexander J. ; Ballou, David P. ; Benore, Marilee (2010). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. (Second ed.). United States of America: John Wiley & Sons, Inc. pp. 161–163. ISBN: 978-0-470-08766-4.
  5. 5- Shapiro AL; Viñuela E; Maizel JV Jr. (September 1967). "Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.". Biochem Biophys Res Commun. 28 (5): 815–820. PMID 4861258. doi:10.1016/0006-291X(67)90391-9.
  6. 6- Weber K, Osborn M (August 1969). "The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.". J Biol Chem. 244 (16): 4406–4412. PMID 5806584.
  7. 7- Laemmli UK (August 1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature. 227 (5259): 680–685. PMID 5432063. doi:10.1038/227680a0.
  8. 8- Caprette, David. "SDS-PAGE". Retrieved 27 September 2009.
  9. 9- "SDS-PAGE". Retrieved 12 September 2009.
  10. 10- Laemmli UK (August 1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". Nature. 227 (5259): 680–685. PMID 5432063. doi:10.1038/227680a0.
  11. 11- Schägger H, von Jagow G (Nov 1987). "Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa". Anal Biochem. 166 (2): 368–379. PMID 2449095. doi:10.1016/0003-2697(87)90587-2.
  12. 12- Andrews. "SDS-PAGE". Retrieved 27 September 2009