واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

از ویکی‌پدیا، دانشنامهٔ آزاد
پرش به: ناوبری، جستجو
PCR masina kasutamine.jpg

واکنش زنجیرهٔ پلیمراز[ویرایش]

واکنش زنجیرهٔ پلیمراز(به انگلیسی: Polymerase Chain Reaction) که مخفف آن (PCR) می‌باشد. واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تکنیکی در زیست شناسی مولکولی است و به منظور تکثیر یک نسخه منفرد یا نسخه های کمی از یک قطعه DNA با توالی خاص به تعداد هزار و یا میلیون ها نسخه به کار می رود. این تکنیک ابزاری آسان و ارزان قیمت برای تکثیر یک قطعه خاص از DNAاست و برای اهدافی همچون تشخیص و نظارت بر بیماری های ژنتیکی، شناسایی مجرمان ( در زمینه پزشکی قانونی) و مطالعه عملکرد یک بخش هدف از DNA مورد استفاده قرار می گیرد [۱].

این تکنیک در سال ۱۹۸۳ بوسیله کری مالیس ابداع شد [۲][۳]).هم اکنون PCR یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه های بالینی و آزمایشگاه های تحقیقاتی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد[۴][۵]). این کاربردها شامل کلونینگ DNA برای توالی یابی، فیلوژنی بر پایه DNA، آنالیز عملکرد ژن ها، تشخیص بیماری های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماری زا در تست های نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماری های عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزه نوبل شیمی را برای کار روی PCR دریافت کردند [۶].

اساس تکنیک PCR چرخه های حرارتی است. این چرخه ها شامل چرخه های گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب DNA و تکثیر آنزیمی DNA است. پرایمرها (قطعات کوتاه DNA) که حاوی توالی مکمل ناحیه هدف اند به همراه یک DNA پلیمراز، اجزای اصلی واکنش PCR برای انتخاب و تکثیر قطعه مورد نظر را تشکیل می دهند. طی فرآیند PCR الگوی DNA بصورت لگاریتمی تکثیر می شود و DNA تکثیر شده خود به عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده می شود. PCR می تواند به شکل گسترده ای برای انجام مراحل مختلف در دستکاری های ژنتیکی استفاده شود.

تقریبا در تمام کاربردهای PCR از یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز(آنزیمی که از باکتری Thermus aquaticus جداسازی شده) استفاده می شود. این DNA پلیمراز از یک DNA ی تک رشته ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمر ها و با بکارگیری نوکلئوتیدها که بلوک های ساختاری DNA هستند، یک رشته DNA ی جدید می سازد. در اغلب روش های PCR از چرخه های حرارتی یعنی گرم و سرد کردن متناوب نمونه های PCR طبق مراحل دمایی مشخص استفاده می شود.

در مرحله اول، دو رشته ی مارپیچ DNA دورشته ای در یک دمای بالا، در فرآیندی که ذوب DNA نامیده می شود از یکدیگر جدا می شوند. در مرحله دوم، دما پایین آورده شده و و هریک از دورشته DNA به عنوان الگو عمل می کنند. ساخته شدن رشته جدید از روی الگو توسط DNA پلیمراز انجام می شود. پرایمر ها بر اساس توالی قطعه ای از DNA که مورد نظر ماست طراحی می شوند.

اصول[ویرایش]

PCR یک ناحیه خاص از رشته DNA (DNA هدف) را تکثیر می کند. به طور معمول اکثر روش های PCR این قابلیت را دارند تا قطعات DNA بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند تکنیک های دیگر می توانند قطعاتی با اندازه های بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند [۷]. مقدار تکثیر محصول بوسیله سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود می کند تعیین می شود [۸].

یک واکنش PCR پایه ای نیازمند چندین جزء است [۹]. این اجزاء شامل موارد زیر است:

  • دی ان ای الگو که حاوی ناحیه DNA ی هدف برای تکثیر است.
  • تگ پلیمراز که یک DNA پلیمراز مقاوم به حرارت است [۱۰]
  • دو پرایمر DNA که مکمل انتهای 3’ رشته های سنس و آنتی سنس DNA ی الگو هستند ( بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشته ای که DNA پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمی شود) [۱۱] . پرایمرهای خاصی که مکمل DNA هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته و یا از تامین کنندگان خریداری می شوند.
  • دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک های ساختاری هستند که DNA پلیمراز با استفاده از آن ها رشته های جدید را می سازد.
  • یک محلول بافری که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری DNA پلیمراز فراهم می کند.
  • کاتیون های دوظرفیتی مانند منیزیوم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداولتر است. همچنین کاتیون Mn2+ می تواند برای جهش زایی DNA ی حاصل از PCR استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می دهد [۱۲].
  • کاتیون های تک ظرفیتی، معمولاً یون های پتاسیم (K)

واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰-۵/۰ میلی لیتر) و در یک چرخه حرارتی انجام می شود. چرخه های حرارتی لوله های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می کنند. بسیاری از چرخه های حرارتی پیشرفته از اثر پلتیر Peltier effect که اجازه گرم و سرد کردن لوله های PCR را بوسیله معکوس کردن جریان الکتریکی می دهد استفاده می کنند.

روش[ویرایش]

به طور کلی PCR شامل مجموعه ای از ۴۰-۲۰ بار تغییر دمایی تکرارشونده به نام سیکل است که هر سیکل متداولاً از دو یا سه مرحله دمایی مستقل تشکیل شده است [۱۳]. مراحل مشترک اغلب روش های PCR عبارت است از:

  1. آغاز: این مرحله برای DNA پلیمرازی که نیازمند فعالسازی گرمایی بوسیله Hot-start PCR است [۱۴] لازم می باشد و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا دمای ۹۶-۹۴ درجه سانتی گراد (۲۰۵-۲۰۱ درجه فارنهایت) یا ۹۸ درجه سانتی گراد ( ۲۰۸ درجه فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰-۱ دقیقه به طول می انجامد.
  2. دناتوراسیون: این مرحله اولین مرحله سیکل است و شامل گرم کردن محفظه واکنش تا ۹۸-۹۴ درجه سانتی گراد (۲۰۸-۲۰۱ درجه فارنهایت) به مدت ۳۰-۲۰ ثانیه می شود که بوسیله شکستن پیوندهای دورشته ای بین بازهای مکمل باعث ذوب شدن یا دناتوراسیون DNA الگوی دورشته ای شده و به این ترتیب دو مولکول DNA تک رشته ای حاصل می شود.
  3. اتصال: در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰-۲۰ ثانیه به ۶۵-۵۰ درجه سانتی گراد کاهش می یابد که باعث می شود پرایمرها به هریک از الگوهای تک رشته DNA متصل شوند. اتصال معمولاً حدود 5-3 درجه سانتی گراد زیر دمای ذوب(Tm پرایمرها انجام می شود. در طول این فرآیند DNA پلیمراز به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته های جدید می کند).
  4. گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد DNA پلیمراز لازم است؛ دمای بهینه یک DNA پلیمراز ۸۰-۷۵ درجه سانتی گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجه سانتی گراد برای این آنزیم استفاده می شود [۱۵][۱۶]). در این مرحله DNA پلیمراز یک رشته DNA ی جدید که مکمل رشته الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ سنتز می کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به DNA پلیمراز استفاده شده و طول ناحیه DNA ی هدف برای تکثیر دارد.

فرآیندهای دناتوراسیون، اتصال و طویل شدن یک سیکل را تشکیل می دهند. برای تکثیر DNA ی هدف تا میلیون ها نسخه، سیکل های متعددی نیاز است.

  1. طویل شدن نهایی: این تک مرحله اختیاری است و پس از آخرین سیکل PCR برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک رشته DNA در یک دمای 74- 70 درجه سانتی گراد (165-158 درجه فارنهایت) به مدت 15- 5 دقیقه انجام می شود.
  2. نگه داری نهایی: مرحله نهایی سرد کردن محفظه واکنش تا 15-4 درجه سانتی گراد برای یک زمان نامحدود است و ممکن است این مرحله برای ذخیره سازی کوتاه مدت محصولات PCR استفاده شود.

به منظور بررسی میزان موفقیت PCR انجام شده از الکتروفورز بر روی ژل (به منظور جداسازی محصولات PCR و بررسی اندازه قطعات استفاده می شود.


در طراحی پرایمربرای واکنش PCR باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً قسمت ۳پریم از پرایمر می بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵ پریم الزامی نمی‌باشد همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آنها تا حد معمول استفاده نشود.معمولاً از گرم کردن و سرد کردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشته DNA و چسبیدن آغازگرها یا Annealing استفاده می شود. در نتیجه این چرخه ها میلیون‌ها نسخه از قطعه کوتاهی از DNA تولید می‌شود.

منابع[ویرایش]

  1. 1. "PCR". Genetic Science Learning Center, University of Utah.
  2. 2. Jump up^ Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 226 (2nd ed.). pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. ISBN 1-59259-384-4.
  3. 3. Jump up^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4,683,195
  4. 4. ^ Jump up to:a b c Saiki, R.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K.; Horn, G.; Erlich, H.; Arnheim, N. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science. 230 (4732): 1350–1354. doi:10.1126/science.2999980. PMID 2999980.
  5. 5. ^ Jump up to:a b Saiki, R.; Gelfand, D.; Stoffel, S.; Scharf, S.; Higuchi, R.; Horn, G.; Mullis, K.; Erlich, H. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487–491. doi:10.1126/science.2448875. PMID 2448875
  6. 6. ^ Jump up to:a b "Kary B. Mullis – Nobel Lecture: The Polymerase Chain Reaction".
  7. 7. Jump up^ Cheng, S.; Fockler, C.; Barnes, W. M.; Higuchi, R. (1994). "Effective Amplification of Long Targets from Cloned Inserts and Human Genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (12): 5695–5699. doi:10.1073/pnas.91.12.5695. PMC 44063 . PMID 8202550.
  8. 8. Jump up^ Carr AC, Moore SD (2012). Lucia, Alejandro, ed. "Robust quantification of polymerase chain reactions using global fitting". PLoS ONE. 7 (5): e37640. doi:10.1371/journal.pone.0037640. PMC 3365123 . PMID 22701526.
  9. 9. ^ Jump up to:a b Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
  10. 10. Jump up^ "Polymerase Chain Reaction (PCR)". National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine.
  11. "PCR". Genetic Science Learning Center, University of Utah.
  12. 11. Jump up^ Pavlov, A. R.; Pavlova, N. V.; Kozyavkin, S. A.; Slesarev, A. I. (2004). "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications☆". Trends in Biotechnology. 22 (5): 253–260. doi:10.1016/j.tibtech.2004.02.011. PMID 15109812.
  13. 12. Jump up^ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucl Acids Res. 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. PMC 332522 . PMID 2243783.
  14. 13. ^ Jump up to:a b Sharkey, D. J.; Scalice, E. R.; Christy, K. G.; Atwood, S. M.; Daiss, J. L. (1994). "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerasehttps://upload.wikimedia.org/wikipedia/fa/4/4a/Button_numbers.png Chain Reaction". Bio/Technology. 12 (5): 506–509. doi:10.1038/nbt0594-506.
  15. 14. ^ Jump up to:a b Chien A, Edgar DB, Trela JM (1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". J. Bacteriol. 127 (3): 1550–1557. PMC 232952 . PMID 8432.
  16. 15. ^ Jump up to:a b Lawyer, F.; Stoffel, S.; Saiki, R.; Chang, S.; Landre, P.; Abramson, R.; Gelfand, D. (1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity". PCR methods and applications. 2 (4): 275–287. doi:10.1101/gr.2.4.275. PMID 8324500.

واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) و مکانیسم آن. کتاب دانش سال راه رشد پروفسور سامان میسمی.

پیوندها[ویرایش]

ویکی‌پدیای انگلیسی