واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: تفاوت میان نسخه‌ها

از ویکی‌پدیا، دانشنامهٔ آزاد
نمایش تاریخچه به صورت تعاملی
→ تفاوت قدیمی‌ترتفاوت جدیدتر ←
محتوای حذف‌شده محتوای افزوده‌شده
دیداریویکی‌متن
بهینه سازی زبان استفاده شده و دقت در توصیف مراحل.
جز واگردانی خودکار خرابکاری بر پایه امتیاز خرابکاری. واگردانی اشتباه ربات را همراه با پیوند تفاوت در کاربر:Dexbot/گزارش اشتباه اعلام کنید. همچنین توصیه میشود حساب کاربری بسازید.
برچسب: واگردانی
خط ۲: خط ۲:


== کلیات ==
== کلیات ==
[[پرونده:PCR masina kasutamine.jpg|thumb]]این فن در سال ۱۹۸۳ توسط [[کری مالیس]] ابداع شد.<ref>2. Jump up^ Bartlett, J. M. S. ; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 226 (2nd ed.). pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. {{شابک|1-59259-384-4}}.</ref><ref>3. Jump up^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4,683,195</ref> هم‌اکنون پی‌سی‌آر یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های پژوهشی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد.<ref>{{Cite journal|last=Saiki|first=R. K.|last2=Scharf|first2=S.|last3=Faloona|first3=F.|last4=Mullis|first4=K. B.|last5=Horn|first5=G. T.|last6=Erlich|first6=H. A.|last7=Arnheim|first7=N.|date=1985-12-20|title=Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2999980/?dopt=Abstract|journal=Science (New York, N.Y.)|volume=230|issue=4732|pages=1350–1354|doi=10.1126/science.2999980|issn=0036-8075|pmid=2999980}}</ref><ref>{{Cite journal|last=Saiki|first=R. K.|last2=Gelfand|first2=D. H.|last3=Stoffel|first3=S.|last4=Scharf|first4=S. J.|last5=Higuchi|first5=R.|last6=Horn|first6=G. T.|last7=Mullis|first7=K. B.|last8=Erlich|first8=H. A.|date=1988-01-29|title=Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2448875/?dopt=Abstract|journal=Science (New York, N.Y.)|volume=239|issue=4839|pages=487–491|doi=10.1126/science.2448875|issn=0036-8075|pmid=2448875}}</ref> این کاربردها شامل تکثیر دی‌اِن‌اِی از طریق همانند سازی ([[شبیه‌سازی (زیست‌شناسی)|کلون‌کردن]]) برای [[توالی‌یابی]]، تبار شناسی ([[فیلوژنتیک|فیلوژنی]]) بر پایهٔ دی‌اِن‌اِی، پژوهش درمورد کارکرد [[ژن]]‌ها، تشخیص بیماری‌های [[وراثت|ارثی]]، شناسایی [[اثر انگشت]] ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل [[بیماری‌زا]] در آزمایش‌های [[نوکلئیک اسید]] برای تشخیص [[بیماری عفونی|بیماری‌های عفونی]] است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با [[مایکل اسمیت]] [[جایزه نوبل شیمی|جایزهٔ نوبل شیمی]] را برای کار روی پی‌سی‌آر دریافت کردند.<ref>{{یادکرد وب|عنوان=The Nobel Prize in Chemistry 1993|نشانی=https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/lecture/|وبگاه=NobelPrize.org|بازبینی=2023-10-19|کد زبان=en-US}}</ref>
[[پرونده:PCR masina kasutamine.jpg|thumb]]این فن در سال ۱۹۸۳ توسط [[کری مالیس]] ابداع شد.<ref>2. Jump up^ Bartlett, J. M. S. ; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 226 (2nd ed.). pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. {{شابک|1-59259-384-4}}.</ref><ref>3. Jump up^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4,683,195</ref> هم‌اکنون پی‌سی‌آر یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های پژوهشی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد.<ref>{{Cite journal|last=Saiki|first=R. K.|last2=Scharf|first2=S.|last3=Faloona|first3=F.|last4=Mullis|first4=K. B.|last5=Horn|first5=G. T.|last6=Erlich|first6=H. A.|last7=Arnheim|first7=N.|date=1985-12-20|title=Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2999980/?dopt=Abstract|journal=Science (New York, N.Y.)|volume=230|issue=4732|pages=1350–1354|doi=10.1126/science.2999980|issn=0036-8075|pmid=2999980}}</ref><ref>{{Cite journal|last=Saiki|first=R. K.|last2=Gelfand|first2=D. H.|last3=Stoffel|first3=S.|last4=Scharf|first4=S. J.|last5=Higuchi|first5=R.|last6=Horn|first6=G. T.|last7=Mullis|first7=K. B.|last8=Erlich|first8=H. A.|date=1988-01-29|title=Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2448875/?dopt=Abstract|journal=Science (New York, N.Y.)|volume=239|issue=4839|pages=487–491|doi=10.1126/science.2448875|issn=0036-8075|pmid=2448875}}</ref> این کاربردها شامل [[شبیه‌سازی (زیست‌شناسی)|کلون‌کردن]] دی‌اِن‌اِی برای [[توالی‌یابی]]، [[فیلوژنتیک|فیلوژنی]] بر پایهٔ دی‌اِن‌اِی، تحلیل کارکرد [[ژن]]‌ها، تشخیص بیماری‌های [[وراثت|ارثی]]، شناسایی [[اثر انگشت]] ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل [[بیماری‌زا]] در آزمایش‌های [[نوکلئیک اسید]] برای تشخیص [[بیماری عفونی|بیماری‌های عفونی]] است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با [[مایکل اسمیت]] [[جایزه نوبل شیمی|جایزهٔ نوبل شیمی]] را برای کار روی پی‌سی‌آر دریافت کردند.<ref>{{یادکرد وب|عنوان=The Nobel Prize in Chemistry 1993|نشانی=https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/1993/mullis/lecture/|وبگاه=NobelPrize.org|بازبینی=2023-10-19|کد زبان=en-US}}</ref>


اساس فن پی‌سی‌آر چرخه‌های دمایی است. هر دور چرخه‌ شامل مرحله گرم برای جدا کردن دو زنجیره دی‌اِن‌اِی (ذوب شدن) و مراحل سردتر برای تکثیر [[آنزیم|آنزیمی]] دی‌اِن‌اِی است. آغازگرها ([[پرایمر (زیست‌شناسی مولکولی)|پرایمرها]]، قطعات کوتاه دی‌اِن‌اِی) که دارای توالی مکمل ناحیهٔ هدف‌اند به همراه یک آنزیم زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی ([[دی‌ان‌ای پلیمراز|دی‌ان‌ای پلیمراز)]]، اجزای اصلی واکنش پی‌سی‌آر برای انتخاب و تکثیر قطعهٔ مورد نظر را تشکیل می‌دهند. در فرایند پی‌سی‌آر الگوی دی‌اِن‌اِی به صورت [[لگاریتم|لگاریتمی]] تکثیر می‌شود و دی‌اِن‌اِی تکثیرشده خود به‌عنوان الگویی برای [[همانندسازی دی‌ان‌ای|همانندسازی]] استفاده می‌شود. پی‌سی‌آر می‌تواند به شکل گسترده‌ای برای انجام مراحل مختلف در [[تراریخته|دستکاری‌های ژنتیکی]] استفاده شود.
اساس فن پی‌سی‌آر چرخه‌های دمایی است. این چرخه‌ها شامل چرخه‌های گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب دی‌اِن‌اِی و تکثیر [[آنزیم|آنزیمی]] دی‌اِن‌اِی است. [[پرایمر (زیست‌شناسی مولکولی)|پرایمرها]] (قطعات کوتاه دی‌اِن‌اِی) که دارای توالی مکمل ناحیهٔ هدف‌اند به همراه یک [[دی‌ان‌ای پلیمراز]]، اجزای اصلی واکنش پی‌سی‌آر برای انتخاب و تکثیر قطعهٔ مورد نظر را تشکیل می‌دهند. در فرایند پی‌سی‌آر الگوی دی‌اِن‌اِی به صورت [[لگاریتم|لگاریتمی]] تکثیر می‌شود و دی‌اِن‌اِی تکثیرشده خود به‌عنوان الگویی برای [[همانندسازی دی‌ان‌ای|همانندسازی]] استفاده می‌شود. پی‌سی‌آر می‌تواند به شکل گسترده‌ای برای انجام مراحل مختلف در [[تراریخته|دستکاری‌های ژنتیکی]] استفاده شود.


تقریباً در همهٔ کاربردهای پی‌سی‌آر از یک زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی مقاوم به حرارت مانند [[تک پلیمراز]] (آنزیمی که از [[باکتری]] ''[[ترموس آکواتیکوس]]'' جداسازی شده) استفاده می‌شود. این زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی از یک دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک [[پرایمر (زیست‌شناسی مولکولی)|آغازگرها]] و با به‌کارگیری [[نوکلئوتید]]ها که بلوک‌های ساختاری دی‌اِن‌اِی هستند، یک رشته دی‌اِن‌اِی جدید می‌سازد.
تقریباً در همهٔ کاربردهای پی‌سی‌آر از یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز مقاوم به حرارت مانند [[تک پلیمراز]] (آنزیمی که از [[باکتری]] ''[[ترموس آکواتیکوس]]'' جداسازی شده) استفاده می‌شود. این دی‌اِن‌اِی پلیمراز از یک دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک [[پرایمر (زیست‌شناسی مولکولی)|پرایمرها]] و با به‌کارگیری [[نوکلئوتید]]ها که بلوک‌های ساختاری دی‌اِن‌اِی هستند، یک رشته دی‌اِن‌اِی جدید می‌سازد. در بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر از چرخه‌های دمایی یعنی گرم و سردکردن متناوب نمونه‌های پی‌سی‌آر بنابر مراحل دمایی مشخص استفاده می‌شود.


در مرحلهٔ نخست، دو رشتهٔ مارپیچ دی‌اِن‌اِی دورشته‌ای در یک دمای بالا، در فرایندی که ذوب دی‌اِن‌اِی نامیده می‌شود از یکدیگر جدا می‌شوند. در مرحلهٔ دوم، دما پایین آورده شده و هریک از دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی به عنوان الگو عمل می‌کنند. ساخته شدن رشتهٔ جدید از روی الگو توسط زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی انجام می‌شود.
در مرحلهٔ نخست، دو رشتهٔ مارپیچ دی‌اِن‌اِی دورشته‌ای در یک دمای بالا، در فرایندی که ذوب دی‌اِن‌اِی نامیده می‌شود از یکدیگر جدا می‌شوند. در مرحلهٔ دوم، دما پایین آورده شده و هریک از دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی به عنوان الگو عمل می‌کنند. ساخته شدن رشتهٔ جدید از روی الگو توسط دی‌اِن‌اِی پلیمراز انجام می‌شود. پرایمرها بر اساس توالی قطعه‌ای از دی‌اِن‌اِی که موردنظر است، طراحی می‌شوند.


== اصول واکنش پی‌سی‌آر ==
== اصول واکنش پی‌سی‌آر ==
خط ۱۵: خط ۱۵:
یک واکنش پی‌سی‌آر پایه‌ای نیازمند چندین جزء است.<ref>9. ^ Jump up to:a b Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press. {{ISBN|0-879-69576-5|en}}. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction</ref> این اجزاء شامل موارد زیر است:
یک واکنش پی‌سی‌آر پایه‌ای نیازمند چندین جزء است.<ref>9. ^ Jump up to:a b Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press. {{ISBN|0-879-69576-5|en}}. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction</ref> این اجزاء شامل موارد زیر است:
* دی‌اِن‌اِی الگو که دارای ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر است.
* دی‌اِن‌اِی الگو که دارای ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر است.
* [[تک پلیمراز]] که یک زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی مقاوم به گرما است.<ref>{{یادکرد وب|عنوان=Polymerase Chain Reaction (PCR)|نشانی=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/|وبگاه=www.ncbi.nlm.nih.gov|بازبینی=2023-10-19}}</ref>
* [[تک پلیمراز]] که یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز مقاوم به گرما است.<ref>{{یادکرد وب|عنوان=Polymerase Chain Reaction (PCR)|نشانی=https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/|وبگاه=www.ncbi.nlm.nih.gov|بازبینی=2023-10-19}}</ref>
* دو آغازگر ([[پرایمر]]). آغازگر ها تک رشته های کوچک دی‌اِن‌اِی که مکمل بخش انتهای (۳’) رشته‌های هم جهت و مخالف دی‌اِن‌اِی الگو هستند و انزیم زنجیره ساز از انتهای '۳ آغازگر ها چسبیده به الگو به عنوان مبدا همانند سازی استفاده می کند.<ref>{{یادکرد وب|عنوان=All About PCR - Beta|نشانی=https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/|وبگاه=learn.genetics.utah.edu|بازبینی=2023-10-19}}</ref> آغازگرها بر اساس توالی قطعه‌ای از دی‌اِن‌اِی که موردنظر است، طراحی می‌شوند. و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین‌کنندگان خریداری می‌شوند.
* دو [[پرایمر]] دی‌اِن‌اِی که مکمل انتهای ۳’ رشته‌های سنس و آنتی‌سنس دی‌اِن‌اِی الگو هستند (بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشته‌ای که دی‌اِن‌اِی پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمی‌شود).<ref>{{یادکرد وب|عنوان=All About PCR - Beta|نشانی=https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/|وبگاه=learn.genetics.utah.edu|بازبینی=2023-10-19}}</ref> پرایمرهای خاصی که مکمل دی‌اِن‌اِی هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین‌کنندگان خریداری می‌شوند.
* دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی با استفاده از آن‌ها رشته‌های جدید را می‌سازد.
* دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که دی‌اِن‌اِی پلیمراز با استفاده از آن‌ها رشته‌های جدید را می‌سازد.
* یک [[محلول بافر|محلول بافری]] که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی فراهم می‌کند.
* یک [[محلول بافر|محلول بافری]] که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری دی‌اِن‌اِی پلیمراز فراهم می‌کند.
* [[کاتیون]]‌های دوظرفیتی مانند [[منیزیم]] (Mg) یا [[منگنز]] (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداول‌تر است. همچنین کاتیون Mn2+ می‌تواند با هدف جهش‌زایی دی‌اِن‌اِی حاصل از پی‌سی‌آر استفاده شود. غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می‌دهد.<ref>{{Cite journal|last=Pavlov|first=Andrey R.|last2=Pavlova|first2=Nadejda V.|last3=Kozyavkin|first3=Sergei A.|last4=Slesarev|first4=Alexei I.|date=Spring 2004|title=Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15109812/?dopt=Abstract|journal=Trends in Biotechnology|volume=22|issue=5|pages=253–260|doi=10.1016/j.tibtech.2004.02.011|issn=0167-7799|pmid=15109812}}</ref>
* [[کاتیون]]‌های دوظرفیتی مانند [[منیزیم]] (Mg) یا [[منگنز]] (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداول‌تر است. همچنین کاتیون Mn2+ می‌تواند برای جهش‌زایی دی‌اِن‌اِی حاصل از پی‌سی‌آر استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می‌دهد.<ref>{{Cite journal|last=Pavlov|first=Andrey R.|last2=Pavlova|first2=Nadejda V.|last3=Kozyavkin|first3=Sergei A.|last4=Slesarev|first4=Alexei I.|date=Spring 2004|title=Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15109812/?dopt=Abstract|journal=Trends in Biotechnology|volume=22|issue=5|pages=253–260|doi=10.1016/j.tibtech.2004.02.011|issn=0167-7799|pmid=15109812}}</ref>
* کاتیون‌های تک‌ظرفیتی، معمولاً یون‌های [[پتاسیم]] (K)
* کاتیون‌های تک‌ظرفیتی، معمولاً یون‌های [[پتاسیم]] (K)
* بافر
* بافر 10X
واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله‌های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰–۵/۰ میلی‌لیتر) و در یک چرخهٔ حرارتی انجام می‌شود. چرخه‌های حرارتی لوله‌های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می‌کنند. بسیاری از چرخه‌های حرارتی پیشرفته از [[اثر پلتیر]] (Peltier effect) که اجازهٔ گرم و سردکردن لوله‌های پی‌سی‌آر را به‌وسیلهٔ معکوس کردن [[جریان الکتریکی]] می‌دهد؛ استفاده می‌کنند.
واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله‌های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰–۵/۰ میلی‌لیتر) و در یک چرخهٔ حرارتی انجام می‌شود. چرخه‌های حرارتی لوله‌های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می‌کنند. بسیاری از چرخه‌های حرارتی پیشرفته از [[اثر پلتیر]] (Peltier effect) که اجازهٔ گرم و سردکردن لوله‌های پی‌سی‌آر را به‌وسیلهٔ معکوس کردن [[جریان الکتریکی]] می‌دهد؛ استفاده می‌کنند.


=== روش ===
=== روش ===
به‌طور کلی پی‌سی‌آر شامل مجموعه‌ای از ۴۰–۲۰ چرخه تغییر دمایی است که هر مرحله چرخه به‌طور متداولً از دو یا سه مرحلهٔ دمایی مستقل تشکیل شده‌است.<ref>{{Cite journal|last=Rychlik|first=W.|last2=Spencer|first2=W. J.|last3=Rhoads|first3=R. E.|date=1990-11-11|title=Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2243783/?dopt=Abstract|journal=Nucleic Acids Research|volume=18|issue=21|pages=6409–6412|doi=10.1093/nar/18.21.6409|issn=0305-1048|pmid=2243783}}</ref>
به‌طور کلی پی‌سی‌آر شامل مجموعه‌ای از ۴۰–۲۰ بار تغییر دمایی تکرارشونده به نام سیکل است که هر سیکل به‌طور متداولً از دو یا سه مرحلهٔ دمایی مستقل تشکیل شده‌است.<ref>{{Cite journal|last=Rychlik|first=W.|last2=Spencer|first2=W. J.|last3=Rhoads|first3=R. E.|date=1990-11-11|title=Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2243783/?dopt=Abstract|journal=Nucleic Acids Research|volume=18|issue=21|pages=6409–6412|doi=10.1093/nar/18.21.6409|issn=0305-1048|pmid=2243783}}</ref> مراحل مشترک بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر عبارت است از:
[[پرونده:PCR gel electrophoresis.jpg|بندانگشتی|[[نشانگر ژنتیکی]] یک [[جاندار]] با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز]]مراحل هر چرخه:
[[پرونده:PCR gel electrophoresis.jpg|بندانگشتی|[[نشانگر ژنتیکی]] یک [[جاندار]] با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز]]
# آغاز: این مرحله برای زنجیره ساز دی‌اِن‌اِیی که نیازمند فعال‌سازی گرمایی توسط Hot-start PCR است<ref>{{Cite journal|last=Sharkey|first=David J.|last2=Scalice|first2=Edward R.|last3=Christy|first3=Kenneth G.|last4=Atwood|first4=Susan M.|last5=Daiss|first5=John L.|date=Spring 1994|title=Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction|url=https://www.nature.com/doifinder/10.1038/nbt0594-506|journal=Bio/Technology|volume=12|issue=5|pages=506–509|doi=10.1038/nbt0594-506|issn=0733-222X}}</ref> لازم است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا دمای ۹۶–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۵–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) یا ۹۸ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸ درجهٔ فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰–۱ دقیقه به طول می‌انجامد.
# آغاز: این مرحله برای دی‌اِن‌اِی پلیمرازی که نیازمند فعال‌سازی گرمایی توسط Hot-start PCR است<ref>{{Cite journal|last=Sharkey|first=David J.|last2=Scalice|first2=Edward R.|last3=Christy|first3=Kenneth G.|last4=Atwood|first4=Susan M.|last5=Daiss|first5=John L.|date=Spring 1994|title=Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction|url=https://www.nature.com/doifinder/10.1038/nbt0594-506|journal=Bio/Technology|volume=12|issue=5|pages=506–509|doi=10.1038/nbt0594-506|issn=0733-222X}}</ref> لازم است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا دمای ۹۶–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۵–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) یا ۹۸ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸ درجهٔ فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰–۱ دقیقه به طول می‌انجامد.
# [[واسرشتن|واسرشتی]] (ذوب شدن): این مرحله نخستین مرحلهٔ چرخه است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا ۹۸–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۳۰–۲۰ ثانیه می‌شود که باعث جداشدن (ذوب یا دناتوراسیون) دی‌اِن‌اِی دورشته‌ای الگو شده و به این ترتیب دو مولکول دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای حاصل می‌شود.
# [[واسرشتن|دناتوراسیون]]: این مرحله نخستین مرحلهٔ سیکل است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا ۹۸–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۳۰–۲۰ ثانیه می‌شود که به‌وسیلهٔ شکستن پیوندهای دورشته‌ای بین بازهای مکمل باعث ذوب شدن یا دناتوراسیون دی‌اِن‌اِی الگوی دورشته‌ای شده و به این ترتیب دو مولکول دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای حاصل می‌شود.
# چسبیدن (اتصال): در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰–۲۰ ثانیه به ۶۵–۵۰ درجهٔ سانتی‌گراد کاهش می‌یابد که باعث می‌شود آغازگرها به هریک از الگوهای تک‌رشتهً دی‌اِن‌اِی متصل شوند. چسبیدن معمولاً حدود ۵–۳ درجهٔ سانتی‌گراد زیر [[نقطه ذوب|دمای ذوب]] (Tm پرایمرها انجام می‌شود. در طول این فرایند زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته‌های جدید می‌کند).
# اتصال: در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰–۲۰ ثانیه به ۶۵–۵۰ درجهٔ سانتی‌گراد کاهش می‌یابد که باعث می‌شود پرایمرها به هریک از الگوهای تک‌رشتهً دی‌اِن‌اِی متصل شوند. اتصال معمولاً حدود ۵–۳ درجهٔ سانتی‌گراد زیر [[نقطه ذوب|دمای ذوب]] (Tm پرایمرها انجام می‌شود. در طول این فرایند دی‌اِن‌اِی پلیمراز به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته‌های جدید می‌کند).
# گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی لازم است؛ دمای بهینهٔ برای فعالیت یک زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی ۸۰–۷۵ درجهٔ سانتی‌گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجهٔ سانتی‌گراد برای این آنزیم استفاده می‌شود.<ref>{{Cite journal|last=Chien|first=A.|last2=Edgar|first2=D. B.|last3=Trela|first3=J. M.|date=Summer 1976|title=Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8432/?dopt=Abstract|journal=Journal of Bacteriology|volume=127|issue=3|pages=1550–1557|doi=10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976|issn=0021-9193|pmid=8432}}</ref><ref>{{Cite journal|last=Lawyer|first=F. C.|last2=Stoffel|first2=S.|last3=Saiki|first3=R. K.|last4=Chang|first4=S. Y.|last5=Landre|first5=P. A.|last6=Abramson|first6=R. D.|last7=Gelfand|first7=D. H.|date=Spring 1993|title=High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8324500/?dopt=Abstract|journal=PCR methods and applications|volume=2|issue=4|pages=275–287|doi=10.1101/gr.2.4.275|issn=1054-9803|pmid=8324500}}</ref> در این مرحله زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی یک رشتهٔ دی‌اِن‌اِی جدید که مکمل رشتهٔ الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ تولید می‌کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به نوع زنجیره ساز دی‌اِن‌اِی استفاده‌شده و طول ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر دارد.
# گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد دی‌اِن‌اِی پلیمراز لازم است؛ دمای بهینهٔ یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز ۸۰–۷۵ درجهٔ سانتی‌گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجهٔ سانتی‌گراد برای این آنزیم استفاده می‌شود.<ref>{{Cite journal|last=Chien|first=A.|last2=Edgar|first2=D. B.|last3=Trela|first3=J. M.|date=Summer 1976|title=Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8432/?dopt=Abstract|journal=Journal of Bacteriology|volume=127|issue=3|pages=1550–1557|doi=10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976|issn=0021-9193|pmid=8432}}</ref><ref>{{Cite journal|last=Lawyer|first=F. C.|last2=Stoffel|first2=S.|last3=Saiki|first3=R. K.|last4=Chang|first4=S. Y.|last5=Landre|first5=P. A.|last6=Abramson|first6=R. D.|last7=Gelfand|first7=D. H.|date=Spring 1993|title=High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity|url=https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8324500/?dopt=Abstract|journal=PCR methods and applications|volume=2|issue=4|pages=275–287|doi=10.1101/gr.2.4.275|issn=1054-9803|pmid=8324500}}</ref> در این مرحله دی‌اِن‌اِی پلیمراز یک رشتهٔ دی‌اِن‌اِی جدید که مکمل رشتهٔ الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ سنتز می‌کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به دی‌اِن‌اِی پلیمراز استفاده‌شده و طول ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر دارد.
هر جداسازی، اتصال و طویل شدن، یک مرحله چرخه را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر دی‌اِن‌اِیِ هدف تا میلیون‌ها نسخه، چرخه های متعددی نیاز است.
فرایندهای دناتوراسیون، اتصال و طویل شدن، یک سیکل را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر دی‌اِن‌اِیِ هدف تا میلیون‌ها نسخه، سیکل‌های متعددی نیاز است.
⚫
# طویل شدن نهایی: این تک‌مرحله اختیاری است و پس از آخرین سیکل پی‌سی‌آر برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک‌رشتهٔ دی‌اِن‌اِی در یک دمای ۷۴–۷۰ درجهٔ سانتی‌گراد (۱۶۵–۱۵۸ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۱۵–۵ دقیقه انجام می‌شود.
⚫
# نگهداری نهایی: مرحلهٔ نهایی سرد کردن محفظهٔ واکنش تا ۱۵–۴ درجهٔ سانتی‌گراد برای یک زمان نامحدود است و ممکن است این مرحله برای ذخیره‌سازی کوتاه‌مدت محصولات پی‌سی‌آر استفاده شود.


⚫
به منظور بررسی میزان موفقیت پی‌سی‌آر انجام‌شده، از [[الکتروفورز ژل|الکتروفورز بر روی ژل]] (به منظور جداسازی محصولات پی‌سی‌آر و بررسی اندازهٔ قطعات، استفاده می‌شود).
مراحل پایانی (بعد از چرخه ها):
⚫
# طویل شدن نهایی: به دلیل کاهش بازده در مراحل پایانی، پس از آخرین سیکل پی‌سی‌آر برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک‌رشتهٔ دی‌اِن‌اِی در یک دمای ۷۴–۷۰ درجهٔ سانتی‌گراد (۱۶۵–۱۵۸ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۱۵–۵ دقیقه انجام می‌شود.
⚫
# نگهداری نهایی: مرحلهٔ نهایی سرد کردن محفظهٔ واکنش تا ۱۵–۴ درجهٔ سانتی‌گراد (برای ذخیره‌سازی کوتاه‌مدت) محصولات پی‌سی‌آر استفاده شود.


⚫
در طراحی پرایمر برای واکنش پی‌سی‌آر باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً بخش ۳' از پرایمر می‌بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵' الزامی نیست. همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر، حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی‌های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آن‌ها تا حد معمول استفاده نشود. معمولاً از گرم‌کردن و سردکردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی و چسبیدن آغازگرها یا Annealing استفاده می‌شود. در نتیجهٔ این چرخه‌ها میلیون‌ها نسخه از قطعهٔ کوتاهی از دی‌اِن‌اِی تولید می‌شود.
⚫
یکی از روش های رایج برای بررسی میزان موفقیت پی‌سی‌آر، از [[الکتروفورز ژل|الکتروفورز بر روی ژل]] (به منظور جداسازی محصولات پی‌سی‌آر و بررسی اندازهٔ قطعات) می باشد.

⚫
در طراحی آغازگر برای واکنش پی‌سی‌آر باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً بخش ۳' از پرایمر می‌بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵' الزامی نیست. همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر، حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی‌های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آن‌ها تا حد معمول استفاده نشود. معمولاً از گرم‌کردن و سردکردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی و چسبیدن آغازگرها یا استفاده می‌شود. در نتیجهٔ این چرخه‌ها میلیون‌ها نسخه از قطعهٔ کوتاهی از دی‌اِن‌اِی تولید می‌شود.

استفاده از [[:en:Dimethyl_sulfoxide|DMSO]] یکی از روش های رایج برای کاهش ساختارهای ثانویه در رشته های الگو و نیز افزایش احتمال موفقیت پی سی آر در رشته های الگوی دارای توالی های بالای تکرار بازهای G و C می باشد.


== روش‌های پی‌سی‌آر ==
== روش‌های پی‌سی‌آر ==

نسخهٔ ‏۲۷ آوریل ۲۰۲۴، ساعت ۲۰:۱۹

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (به انگلیسی: Polymerase chain reaction) که مخفف آن پی‌سی‌آر است، فنی در زیست‌شناسی مولکولی برای تکثیر یک نسخهٔ منفرد یا نسخه‌های کمی از یک قطعه دی‌اِن‌اِی با توالی خاص، به‌شمار هزار یا میلیون‌ها نسخه است. این فن ابزاری آسان و ارزان‌قیمت برای تکثیر یک تکهٔ خاص از دی‌اِن‌اِی است و برای اهدافی همچون تشخیص و نظارت بر بیماری‌های ژنتیکی، شناسایی مجرمان (در زمینهٔ پزشکی قانونی) و مطالعهٔ کارکرد یک بخش هدف از دی‌اِن‌اِی به‌کار می‌رود.[۱]

کلیات

این فن در سال ۱۹۸۳ توسط کری مالیس ابداع شد.[۲][۳] هم‌اکنون پی‌سی‌آر یک تکنیک متداول و اغلب ضروری در آزمایشگاه‌های بالینی و آزمایشگاه‌های پژوهشی است و در موارد گوناگونی کاربرد دارد.[۴][۵] این کاربردها شامل کلون‌کردن دی‌اِن‌اِی برای توالی‌یابی، فیلوژنی بر پایهٔ دی‌اِن‌اِی، تحلیل کارکرد ژن‌ها، تشخیص بیماری‌های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علم پزشکی قانونی) و تشخیص عوامل بیماری‌زا در آزمایش‌های نوکلئیک اسید برای تشخیص بیماری‌های عفونی است. در سال ۱۹۹۳ مولیس همراه با مایکل اسمیت جایزهٔ نوبل شیمی را برای کار روی پی‌سی‌آر دریافت کردند.[۶]

اساس فن پی‌سی‌آر چرخه‌های دمایی است. این چرخه‌ها شامل چرخه‌های گرمایی و سرمایی تکراری، ذوب دی‌اِن‌اِی و تکثیر آنزیمی دی‌اِن‌اِی است. پرایمرها (قطعات کوتاه دی‌اِن‌اِی) که دارای توالی مکمل ناحیهٔ هدف‌اند به همراه یک دی‌ان‌ای پلیمراز، اجزای اصلی واکنش پی‌سی‌آر برای انتخاب و تکثیر قطعهٔ مورد نظر را تشکیل می‌دهند. در فرایند پی‌سی‌آر الگوی دی‌اِن‌اِی به صورت لگاریتمی تکثیر می‌شود و دی‌اِن‌اِی تکثیرشده خود به‌عنوان الگویی برای همانندسازی استفاده می‌شود. پی‌سی‌آر می‌تواند به شکل گسترده‌ای برای انجام مراحل مختلف در دستکاری‌های ژنتیکی استفاده شود.

تقریباً در همهٔ کاربردهای پی‌سی‌آر از یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز مقاوم به حرارت مانند تک پلیمراز (آنزیمی که از باکتری ترموس آکواتیکوس جداسازی شده) استفاده می‌شود. این دی‌اِن‌اِی پلیمراز از یک دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای به عنوان الگو استفاده کرده و با کمک پرایمرها و با به‌کارگیری نوکلئوتیدها که بلوک‌های ساختاری دی‌اِن‌اِی هستند، یک رشته دی‌اِن‌اِی جدید می‌سازد. در بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر از چرخه‌های دمایی یعنی گرم و سردکردن متناوب نمونه‌های پی‌سی‌آر بنابر مراحل دمایی مشخص استفاده می‌شود.

در مرحلهٔ نخست، دو رشتهٔ مارپیچ دی‌اِن‌اِی دورشته‌ای در یک دمای بالا، در فرایندی که ذوب دی‌اِن‌اِی نامیده می‌شود از یکدیگر جدا می‌شوند. در مرحلهٔ دوم، دما پایین آورده شده و هریک از دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی به عنوان الگو عمل می‌کنند. ساخته شدن رشتهٔ جدید از روی الگو توسط دی‌اِن‌اِی پلیمراز انجام می‌شود. پرایمرها بر اساس توالی قطعه‌ای از دی‌اِن‌اِی که موردنظر است، طراحی می‌شوند.

اصول واکنش پی‌سی‌آر

پی‌سی‌آر یک ناحیهٔ خاص از رشتهٔ دی‌اِن‌اِی هدف را تکثیر می‌کند. به‌طور معمول بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر این قابلیت را دارند تا قطعات دی‌اِن‌اِی بین ۱/۰ و ۱۰ کیلوجفت‌باز (kbp) را تکثیر کنند. هرچند فنون دیگر می‌توانند قطعاتی با اندازه‌های بالاتر از ۴۰ کیلوجفت باز را نیز تکثیر کنند.[۷] مقدار تکثیر محصول توسط سوبسترای موجود در واکنش که پیشرفت واکنش را محدود می‌کند تعیین می‌شود.[۸]

یک واکنش پی‌سی‌آر پایه‌ای نیازمند چندین جزء است.[۹] این اجزاء شامل موارد زیر است:

  • دی‌اِن‌اِی الگو که دارای ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر است.
  • تک پلیمراز که یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز مقاوم به گرما است.[۱۰]
  • دو پرایمر دی‌اِن‌اِی که مکمل انتهای ۳’ رشته‌های سنس و آنتی‌سنس دی‌اِن‌اِی الگو هستند (بدون پرایمرها، جایگاه آغاز دورشته‌ای که دی‌اِن‌اِی پلیمراز بتواند به آن متصل شود شناخته نمی‌شود).[۱۱] پرایمرهای خاصی که مکمل دی‌اِن‌اِی هدف هستند از قبل انتخاب شده و به شکل سفارشی در آزمایشگاه ساخته یا از تأمین‌کنندگان خریداری می‌شوند.
  • دزوکسی نوکلئوتیدهای سه فسفاته یا dNTPs بلوک‌های ساختاری هستند که دی‌اِن‌اِی پلیمراز با استفاده از آن‌ها رشته‌های جدید را می‌سازد.
  • یک محلول بافری که محیط شیمیایی مناسبی برای بهبود فعالیت و پایداری دی‌اِن‌اِی پلیمراز فراهم می‌کند.
  • کاتیون‌های دوظرفیتی مانند منیزیم (Mg) یا منگنز (Mn)؛ کاتیون Mg2+ متداول‌تر است. همچنین کاتیون Mn2+ می‌تواند برای جهش‌زایی دی‌اِن‌اِی حاصل از پی‌سی‌آر استفاده شود و غلظت بالای این یون نرخ خطا را در طول سنتز افزایش می‌دهد.[۱۲]
  • کاتیون‌های تک‌ظرفیتی، معمولاً یون‌های پتاسیم (K)
  • بافر 10X

واکنش معمولاً در حجم ۱۰ تا ۲۰۰ میکرولیتر در لوله‌های کوچک واکنش (با حجم ۲/۰–۵/۰ میلی‌لیتر) و در یک چرخهٔ حرارتی انجام می‌شود. چرخه‌های حرارتی لوله‌های واکنش را به منظور فراهم کردن دمای لازم در هر مرحله سرد و گرم می‌کنند. بسیاری از چرخه‌های حرارتی پیشرفته از اثر پلتیر (Peltier effect) که اجازهٔ گرم و سردکردن لوله‌های پی‌سی‌آر را به‌وسیلهٔ معکوس کردن جریان الکتریکی می‌دهد؛ استفاده می‌کنند.

روش

به‌طور کلی پی‌سی‌آر شامل مجموعه‌ای از ۴۰–۲۰ بار تغییر دمایی تکرارشونده به نام سیکل است که هر سیکل به‌طور متداولً از دو یا سه مرحلهٔ دمایی مستقل تشکیل شده‌است.[۱۳] مراحل مشترک بیشتر روش‌های پی‌سی‌آر عبارت است از:

نشانگر ژنتیکی یک جاندار با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
  1. آغاز: این مرحله برای دی‌اِن‌اِی پلیمرازی که نیازمند فعال‌سازی گرمایی توسط Hot-start PCR است[۱۴] لازم است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا دمای ۹۶–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۵–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) یا ۹۸ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸ درجهٔ فارنهایت) برای پلیمرازهای بسیار مقاوم به حرارت است. این مرحله ۱۰–۱ دقیقه به طول می‌انجامد.
  2. دناتوراسیون: این مرحله نخستین مرحلهٔ سیکل است و شامل گرم کردن محفظهٔ واکنش تا ۹۸–۹۴ درجهٔ سانتی‌گراد (۲۰۸–۲۰۱ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۳۰–۲۰ ثانیه می‌شود که به‌وسیلهٔ شکستن پیوندهای دورشته‌ای بین بازهای مکمل باعث ذوب شدن یا دناتوراسیون دی‌اِن‌اِی الگوی دورشته‌ای شده و به این ترتیب دو مولکول دی‌اِن‌اِی تک‌رشته‌ای حاصل می‌شود.
  3. اتصال: در این مرحله دمای واکنش به مدت ۴۰–۲۰ ثانیه به ۶۵–۵۰ درجهٔ سانتی‌گراد کاهش می‌یابد که باعث می‌شود پرایمرها به هریک از الگوهای تک‌رشتهً دی‌اِن‌اِی متصل شوند. اتصال معمولاً حدود ۵–۳ درجهٔ سانتی‌گراد زیر دمای ذوب (Tm پرایمرها انجام می‌شود. در طول این فرایند دی‌اِن‌اِی پلیمراز به ترکیبی از الگو و پرایمر متصل و شروع به ایجاد رشته‌های جدید می‌کند).
  4. گسترش/ طویل شدن: در این مرحله دما برای عملکرد دی‌اِن‌اِی پلیمراز لازم است؛ دمای بهینهٔ یک دی‌اِن‌اِی پلیمراز ۸۰–۷۵ درجهٔ سانتی‌گراد است. با این وجود معمولاً دمای ۷۲ درجهٔ سانتی‌گراد برای این آنزیم استفاده می‌شود.[۱۵][۱۶] در این مرحله دی‌اِن‌اِی پلیمراز یک رشتهٔ دی‌اِن‌اِی جدید که مکمل رشتهٔ الگو است را در جهت ’۵ به ’۳ سنتز می‌کند. زمان لازم برای افزایش طول بستگی به دی‌اِن‌اِی پلیمراز استفاده‌شده و طول ناحیهٔ دی‌اِن‌اِی هدف برای تکثیر دارد.

فرایندهای دناتوراسیون، اتصال و طویل شدن، یک سیکل را تشکیل می‌دهند. برای تکثیر دی‌اِن‌اِیِ هدف تا میلیون‌ها نسخه، سیکل‌های متعددی نیاز است.

  1. طویل شدن نهایی: این تک‌مرحله اختیاری است و پس از آخرین سیکل پی‌سی‌آر برای اطمینان از طویل شدن کامل هر تک‌رشتهٔ دی‌اِن‌اِی در یک دمای ۷۴–۷۰ درجهٔ سانتی‌گراد (۱۶۵–۱۵۸ درجهٔ فارنهایت) به مدت ۱۵–۵ دقیقه انجام می‌شود.
  2. نگهداری نهایی: مرحلهٔ نهایی سرد کردن محفظهٔ واکنش تا ۱۵–۴ درجهٔ سانتی‌گراد برای یک زمان نامحدود است و ممکن است این مرحله برای ذخیره‌سازی کوتاه‌مدت محصولات پی‌سی‌آر استفاده شود.

به منظور بررسی میزان موفقیت پی‌سی‌آر انجام‌شده، از الکتروفورز بر روی ژل (به منظور جداسازی محصولات پی‌سی‌آر و بررسی اندازهٔ قطعات، استفاده می‌شود).

در طراحی پرایمر برای واکنش پی‌سی‌آر باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلاً حتماً بخش ۳' از پرایمر می‌بایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش ۵' الزامی نیست. همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر، حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی‌های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آن‌ها تا حد معمول استفاده نشود. معمولاً از گرم‌کردن و سردکردن مخلوط واکنش برای جدا شدن دو رشتهٔ دی‌اِن‌اِی و چسبیدن آغازگرها یا Annealing استفاده می‌شود. در نتیجهٔ این چرخه‌ها میلیون‌ها نسخه از قطعهٔ کوتاهی از دی‌اِن‌اِی تولید می‌شود.

روش‌های پی‌سی‌آر

  • تاچ‌داون پی‌سی‌آر (Touchdown)
  • واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس (Reverse Transcription-PCR) یا (RT- PCR)
  • واکنش زنجیره‌ای پلیمراز نامتقارن(Asymmetric PCR)
  • پی‌سی‌آر AFLP
  • پی‌سی‌آر In-silico
  • پی‌سی‌آر آشیانه (Nested)
  • پی‌سی‌آر ویژه آلل (Allele specific PCR) یا (Tetra-primer ARMS PCR)
  • پی‌سی‌آر کلونی (Colony PCR)
  • پی‌سی‌آر دژنره (Degenerate PCR)
  • پی‌سی‌آر هات استارت (Hotstart PCR)
  • پی‌سی‌آر معکوس (Inverse PCR)
  • پی‌سی‌آر مینی پرایمر (Miniprimer PCR)
  • پی‌سی‌آر چندگانه (Multiplex PCR)
  • پی‌سی‌آر Alu
  • پی‌سی‌آر Assembly
  • پی‌سی‌آر ISSR
  • پی‌سی‌آر LATE
  • پی‌سی‌آر Long Range
  • پی‌سی‌آر Methylation-specific
  • پی‌سی‌آر rep
  • پی‌سی‌آر ARMS
  • پی‌سی‌آر Core sample
  • پی‌سی‌آر Dial-out
  • پی‌سی‌آر Digital
  • پی‌سی‌آر Droplet Digital
  • پی‌سی‌آر Ligation-mediated
  • پی‌سی‌آر Suicide
  • پی‌سی‌آر Helicase-dependent amplification
  • پی‌سی‌آر Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
  • پی‌سی‌آر TAIL
  • پی‌سی‌آر High Fidelity
  • پی‌سی‌آر GC-Rich
  • پی‌سی‌آر Nano
  • پی‌سی‌آر فاز جامد (SP-PCR)

جستارهای وابسته

منابع

  1. ↑ 1. "PCR". Genetic Science Learning Center, University of Utah.
  2. ↑ 2. Jump up^ Bartlett, J. M. S. ; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 226 (2nd ed.). pp. 3–6. doi:10.1385/1-59259-384-4:3. شابک ‎۱−۵۹۲۵۹−۳۸۴−۴.
  3. ↑ 3. Jump up^ Mullis, Kary B. et al. "Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences" U.S. Patent 4,683,195
  4. ↑ Saiki, R. K.; Scharf, S.; Faloona, F.; Mullis, K. B.; Horn, G. T.; Erlich, H. A.; Arnheim, N. (1985-12-20). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science (New York, N.Y.). 230 (4732): 1350–1354. doi:10.1126/science.2999980. ISSN 0036-8075. PMID 2999980.
  5. ↑ Saiki, R. K.; Gelfand, D. H.; Stoffel, S.; Scharf, S. J.; Higuchi, R.; Horn, G. T.; Mullis, K. B.; Erlich, H. A. (1988-01-29). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science (New York, N.Y.). 239 (4839): 487–491. doi:10.1126/science.2448875. ISSN 0036-8075. PMID 2448875.
  6. ↑ «The Nobel Prize in Chemistry 1993». NobelPrize.org (به انگلیسی). دریافت‌شده در ۲۰۲۳-۱۰-۱۹.
  7. ↑ Cheng, S.; Fockler, C.; Barnes, W. M.; Higuchi, R. (1994-06-07). "Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12): 5695–5699. doi:10.1073/pnas.91.12.5695. ISSN 0027-8424. PMID 8202550.
  8. ↑ Carr, Ana C.; Moore, Sean D. (2012). "Robust quantification of polymerase chain reactions using global fitting". PloS One. 7 (5): e37640. doi:10.1371/journal.pone.0037640. ISSN 1932-6203. PMC 3365123. PMID 22701526.
  9. ↑ 9. ^ Jump up to:a b Joseph Sambrook & David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor, N.Y. : Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 0-879-69576-5. Chapter 8: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction
  10. ↑ «Polymerase Chain Reaction (PCR)». www.ncbi.nlm.nih.gov. دریافت‌شده در ۲۰۲۳-۱۰-۱۹.
  11. ↑ «All About PCR - Beta». learn.genetics.utah.edu. دریافت‌شده در ۲۰۲۳-۱۰-۱۹.
  12. ↑ Pavlov, Andrey R.; Pavlova, Nadejda V.; Kozyavkin, Sergei A.; Slesarev, Alexei I. (Spring 2004). "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications". Trends in Biotechnology. 22 (5): 253–260. doi:10.1016/j.tibtech.2004.02.011. ISSN 0167-7799. PMID 15109812.
  13. ↑ Rychlik, W.; Spencer, W. J.; Rhoads, R. E. (1990-11-11). "Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro". Nucleic Acids Research. 18 (21): 6409–6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409. ISSN 0305-1048. PMID 2243783.
  14. ↑ Sharkey, David J.; Scalice, Edward R.; Christy, Kenneth G.; Atwood, Susan M.; Daiss, John L. (Spring 1994). "Antibodies as Thermolabile Switches: High Temperature Triggering for the Polymerase Chain Reaction". Bio/Technology. 12 (5): 506–509. doi:10.1038/nbt0594-506. ISSN 0733-222X.
  15. ↑ Chien, A.; Edgar, D. B.; Trela, J. M. (Summer 1976). "Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus". Journal of Bacteriology. 127 (3): 1550–1557. doi:10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976. ISSN 0021-9193. PMID 8432.
  16. ↑ Lawyer, F. C.; Stoffel, S.; Saiki, R. K.; Chang, S. Y.; Landre, P. A.; Abramson, R. D.; Gelfand, D. H. (Spring 1993). "High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity". PCR methods and applications. 2 (4): 275–287. doi:10.1101/gr.2.4.275. ISSN 1054-9803. PMID 8324500.

واکنش زنجیره پلیمراز (PCR) و مکانیسم آن. کتاب دانش سال راه رشد سامان میسمی.

پیوندها

ویکی‌پدیای انگلیسی

برگرفته از «https://fa.wikipedia.org/w/index.php?title=واکنش_زنجیره‌ای_پلیمراز&oldid=39399595»