پیش‌نویس:طیف‌سنجی فلورسانس

طیف سنجی فلورسانس (همچنین به عنوان فلوئوریمتری یا طیف فلورومتری شناخته می شود) نوعی طیف سنجی الکترومغناطیسی است که فلورسانس را از یک نمونه تجزیه و تحلیل می کند. این شامل استفاده از یک پرتو نور، معمولاً نور ماوراء بنفش، است که الکترون‌های موجود در مولکول‌های ترکیبات خاص را تحریک می‌کند و باعث می‌شود آنها نور ساطع کنند. به طور معمول، اما نه لزوما، نور مرئی. یک تکنیک مکمل، طیف‌سنجی جذبی است. در مورد خاص طیف‌سنجی فلورسانس تک مولکولی، نوسانات شدت نور ساطع شده از فلوروفورهای منفرد یا جفت فلوروفور اندازه‌گیری می‌شود.

دستگاه هایی که فلورسانس را اندازه گیری می کنند فلورومتر نامیده می شوند.

تحقیقات[ویرایش]

مولکول ها حالت های مختلفی دارند که به آن ها سطوح انرژی گفته می شود. طیف سنجی فلورسانس در درجه اول مربوط به حالت های الکترونیکی و ارتعاشی است. به طور کلی، گونه هایی که مورد بررسی قرار می گیرند دارای یک حالت الکترونیکی زمینی (حالت انرژی پایه)و یک حالت الکترونیکی برانگیخته با انرژی بالاتر هستند. در هر یک از این حالت های الکترونیکی حالت های ارتعاشی مختلفی وجود دارد.

در فلورسانس، گونه ابتدا با جذب یک فوتون، از حالت الکترونیکی پایه خود به یکی از حالات ارتعاشی مختلف در حالت الکترونیکی برانگیخته، برانگیخته می شود. برخورد با مولکول های دیگر باعث می شود که مولکول برانگیخته انرژی ارتعاشی خود را از دست بدهد تا زمانی که از حالت الکترونیکی برانگیخته به پایین ترین حالت ارتعاشی برسد. این فرآیند اغلب با نمودار جابلونسکی تجسم می شود.

سپس مولکول دوباره به یکی از سطوح مختلف ارتعاشی حالت الکترونیکی زمین سقوط می کند و در این فرآیند یک فوتون ساطع می کند. از آنجایی که مولکول ها ممکن است به هر یک از چندین سطح ارتعاشی در حالت پایه سقوط کنند، فوتون های ساطع شده انرژی ها و در نتیجه فرکانس های متفاوتی خواهند داشت. بنابراین، با تجزیه و تحلیل فرکانس های مختلف نور ساطع شده در طیف سنجی فلورسنت، همراه با شدت نسبی آنها، می توان ساختار سطوح مختلف ارتعاشی را تعیین کرد.

برای گونه های اتمی، فرآیند مشابه است. با این حال، از آنجایی که گونه های اتمی دارای سطوح انرژی ارتعاشی نیستند، فوتون های ساطع شده اغلب در همان طول موج تابش فرودی هستند. این فرآیند گسیل مجدد فوتون جذب شده "فلورسانس تشدید" است و در حالی که مشخصه فلورسانس اتمی است، در فلورسانس مولکولی نیز دیده می شود.

در اندازه‌گیری فلورسانس معمولی (گسیل)، طول موج تحریک ثابت است و طول موج تشخیص متفاوت است، در حالی که در اندازه‌گیری تحریک فلورسانس، طول موج تشخیص ثابت است و طول موج تحریک در منطقه مورد نظر تغییر می‌کند. نقشه انتشار با ثبت طیف های انتشار حاصل از طیف وسیعی از طول موج های تحریک و ترکیب همه آنها با هم اندازه گیری می شود. این یک مجموعه داده سطح سه بعدی است: شدت انتشار به عنوان تابعی از تحریک و طول موج انتشار، و معمولاً به عنوان یک نقشه کانتور نشان داده می شود.

ابزار[ویرایش]

دو نوع کلی از ابزارها وجود دارد: فیلتر فلورومتر که از فیلترها برای جداسازی نور حادثه و نور فلورسنت و اسپکتروفلورومترها استفاده می کنند که از تک رنگ کننده های پراش برای جداسازی نور حادثه و نور فلورسنت استفاده می کنند.

هر دو نوع از طرح زیر استفاده می کنند: نور یک منبع تحریک کننده از یک فیلتر یا تک رنگ عبور می کند و به نمونه برخورد می کند. بخشی از نور تابشی توسط نمونه جذب می شود و برخی از مولکول های موجود در فلورسنت نمونه جذب می شوند. نور فلورسنت در تمام جهات منتشر می شود. برخی از این نور فلورسنت از فیلتر دوم یا تک رنگ عبور می کند و به آشکارساز می رسد که معمولا در معرض خطر قرار می گیرد.

منابع نوری مختلفی ممکن است به عنوان منابع تحریک کننده مورد استفاده قرار گیرند، از جمله لیزرها، LED ها و لامپ ها؛ کمان های زنون و لامپ های جیوه ای به طور خاص. یک لیزر تنها نور با تابش بالا را در فاصله طول موج بسیار باریک منتشر می کند، که معمولا زیر ۰.۰۱ نانومتر است، که یک تک رنگ تحریک کننده یا فیلتر را غیر ضروری می سازد. عیب این روش این است که طول موج لیزر را نمی توان با مقدار زیادی تغییر داد.

فیلترها و تک رنگ کننده ها ممکن است در فلوئورسنت ها مورد استفاده قرار گیرند. یک تک رنگ کننده نور یک طول موج قابل تنظیم با تحمل قابل تنظیم را انتقال می دهد. رایج ترین نوع تک رنگ کننده از یک فیلتر پراش استفاده می کند، یعنی نور کلاژ شده یک فیلتر را روشن می کند و با زاویه متفاوتی بسته به طول موج خارج می شود. سپس تک رنگ کننده می تواند تنظیم شود تا انتخاب کند که کدام طول موج را انتقال دهد.

همانطور که قبلا ذکر شد، فلورسانس اغلب در زاویه ۹۰ درجه نسبت به نور تحریک اندازه گیری می شود. این هندسه به جای قرار دادن سنسور در خط نور تحریک در زاویه ۱۸۰ درجه به منظور جلوگیری از تداخل نور تحریک منتقل شده استفاده می شود.هیچ تک رنگ کننده ای کامل نیست و مقداری نور سرگردان را منتقل می کند، یعنی نوری با طول موج های دیگر نسبت به هدف.یک تک رنگ کننده ایده آل تنها نور را در محدوده مشخص شده انتقال می دهد و انتقال وابسته به طول موج بالایی دارد.هنگام اندازه گیری در زاویه ۹۰ درجه، تنها نور پراکنده شده توسط نمونه باعث ایجاد نور سرگردان می شود.این امر منجر به نسبت سیگنال به نویز بهتری می شود و حد تشخیص را در مقایسه با هندسه۱۸۰^[۱]، تا حدود ۱۰۰۰۰ کاهش می دهد.علاوه بر این، فلورسانس را می توان از جلو نیز اندازه گیری کرد، که اغلب برای نمونه های کدر یا مات انجام می شود.^[۲]

آشکارساز می تواند تک کاناله یا چند کاناله باشد.آشکارساز تک کاناله تنها می تواند شدت یک طول موج را در یک زمان تشخیص دهد، در حالی که آشکارساز چند کاناله شدت تمام طول موج ها را به طور همزمان تشخیص می دهد، که باعث می شود تک رنگ انتشار یا فیلتر غیرضروری باشد.

متنوع ترین فلوریومترها با تک رنگ کننده های دوگانه و یک منبع نور تحریک پیوسته می توانند هم طیف تحریک و هم طیف فلورسانس را ثبت کنند.هنگام اندازه گیری طیف های فلورسانس، طول موج نور تحریک ثابت نگه داشته می شود، ترجیحا در طول موج جذب بالا، و تک رنگ انتشار طیف را اسکن می کند.برای اندازه گیری طیف های تحریک، طول موج عبوری از فیلتر انتشار یا تک رنگ کننده ثابت نگه داشته می شود و تک رنگ کننده تحریک در حال اسکن است.طیف تحریک به طور کلی با طیف جذب یک سان است زیرا شدت فلورسانس متناسب با جذب است.^[۳]

تجزیه و تحلیل داده ها[ویرایش]

در غلظت های پایین شدت فلورسانس عموما متناسب با غلظت فلوروفور خواهد بود.

برخلاف طیف‌سنجی UV/مرئی، طیف‌های «استاندارد» مستقل از دستگاه به راحتی به دست نمی‌آیند. چندین عامل بر طیف‌ها تأثیر می‌گذارند و آن‌ها را تحریف می‌کنند و برای دستیابی به طیف‌های «درست»، یعنی طیف‌های مستقل از ماشین، اصلاحات لازم است. انواع مختلف اعوجاج ها در اینجا به عنوان مرتبط با ابزار یا نمونه طبقه بندی می شوند. در ابتدا، اعوجاج ناشی از ابزار مورد بحث قرار می گیرد. برای شروع، شدت منبع نور و ویژگی های طول موج در طول زمان در طول هر آزمایش و بین هر آزمایش متفاوت است. علاوه بر این، هیچ لامپی در تمام طول موج ها شدت ثابتی ندارد. برای تصحیح این، می توان یک تقسیم کننده پرتو را بعد از تک رنگ یا فیلتر تحریک اعمال کرد تا بخشی از نور را به یک آشکارساز مرجع هدایت کند.

علاوه بر این، راندمان انتقال تک رنگ و فیلترها باید در نظر گرفته شود. اینها نیز ممکن است در طول زمان تغییر کنند. راندمان انتقال تک رنگ نیز بسته به طول موج متفاوت است. به همین دلیل است که یک آشکارساز مرجع اختیاری باید بعد از تک رنگ یا فیلتر تحریک قرار گیرد. درصد فلورسانس دریافتی توسط آشکارساز نیز به سیستم بستگی دارد. علاوه بر این، بازده کوانتومی آشکارساز، یعنی درصد فوتون های شناسایی شده، بین آشکارسازهای مختلف، با طول موج و با زمان متفاوت است، زیرا آشکارساز به طور اجتناب ناپذیری خراب می شود.

دو موضوع دیگر که باید در نظر گرفته شوند عبارتند از اپتیک مورد استفاده برای هدایت تابش و وسایل نگهداری یا نگهداری مواد نمونه (به نام کووت یا سلول). برای اکثر اندازه گیری های UV، مرئی و NIR استفاده از کووت های کوارتز دقیق ضروری است. در هر دو مورد، انتخاب موادی که جذب نسبتا کمی در محدوده طول موج مورد نظر دارند، مهم است. کوارتز ایده آل است زیرا از 200 nm-2500 nm ارسال می کند. کوارتز درجه بالاتر حتی می تواند تا 3500 نانومتر را انتقال دهد، در حالی که خواص جذب مواد دیگر می تواند فلورسانس نمونه را بپوشاند.

تصحیح همه این عوامل ابزاری برای به دست آوردن یک طیف "استاندارد" یک فرآیند خسته کننده است که فقط در صورت لزوم در عمل اعمال می شود. این مورد در هنگام اندازه گیری تسلیم کوانتومی یا یافتن طول موج با بالاترین شدت انتشار است.

همانطور که قبلا ذکر شد، اعوجاج از نمونه نیز به وجود می آید. بنابراین، برخی از جنبه های نمونه نیز باید در نظر گرفته شود. اولاً، تجزیه نوری ممکن است شدت فلورسانس را در طول زمان کاهش دهد. پراکندگی نور نیز باید در نظر گرفته شود. مهم ترین انواع پراکندگی در این زمینه پراکندگی رایلی و رامان است. نور پراکنده شده توسط پراکندگی ریلی دارای طول موج مشابه نور فرودی است، در حالی که در پراکندگی رامان، نور پراکنده معمولاً طول موج را به طول موج های بلندتر تغییر می دهد. پراکندگی رامان نتیجه یک حالت الکترونیکی مجازی است که توسط نور تحریک القا می شود. از این حالت مجازی، مولکول ها ممکن است به سطح ارتعاشی غیر از حالت پایه ارتعاشی برگردند. در طیف های فلورسانس، همیشه در یک اختلاف عدد موج ثابت نسبت به عدد موج تحریک دیده می شود، به عنوان مثال. اوج در یک عدد موج 3600 سانتی متر-1 کمتر از نور تحریک در آب ظاهر می شود.

جنبه های دیگری که باید در نظر گرفته شود اثرات فیلتر داخلی است^[۴]^[۵]اینها شامل بازجذب است. بازجذب به این دلیل اتفاق می‌افتد که یک مولکول دیگر یا بخشی از یک ماکرومولکول در طول موج‌هایی که فلوروفور تشعشع می‌کند جذب می‌شود. اگر چنین باشد، ممکن است برخی یا همه فوتون‌های ساطع شده توسط فلوروفور دوباره جذب شوند. یکی دیگر از اثرات فیلتر داخلی به دلیل غلظت بالای مولکول های جذب کننده از جمله فلوروفور رخ می دهد. نتیجه این است که شدت نور تحریک در سراسر محلول ثابت نیست. در نتیجه، تنها درصد کمی از نور تحریک به فلوروفورهایی می رسد که برای سیستم تشخیص قابل مشاهده هستند. اثرات فیلتر داخلی طیف و شدت نور ساطع شده را تغییر می دهد و بنابراین باید هنگام تجزیه و تحلیل طیف انتشار نور فلورسنت در نظر گرفته شود.^[۶]^[۷]

فلورسانس تریپتوفان[ویرایش]

فلورسانس یک پروتئین تا شده مخلوطی از فلورسانس از بقایای معطر منفرد است. بیشتر انتشار فلورسانس ذاتی یک پروتئین چین خورده به دلیل تحریک باقیمانده های تریپتوفان و برخی انتشارات ناشی از تیروزین و فنیل آلانین است. اما پیوندهای دی سولفید نیز در این محدوده طول موج جذب قابل توجهی دارند. به طور معمول، تریپتوفان دارای طول موج حداکثر جذب 280 نانومتر و پیک انتشار است که سولواتوکرومیک است که از حدود حدودا متغیر است. 300 تا 350 نانومتر بسته به قطبیت محیط محلی، بنابراین، فلورسانس پروتئین ممکن است به عنوان تشخیص وضعیت ساختاری یک پروتئین استفاده شود. علاوه بر این، فلورسانس تریپتوفان به شدت تحت تأثیر نزدیکی باقی مانده های دیگر قرار می گیرد (یعنی گروه های پروتونه شده نزدیک مانند Asp یا Glu می توانند باعث خاموش شدن فلورسانس Trp شوند). همچنین، انتقال انرژی بین تریپتوفان و سایر اسیدهای آمینه فلورسنت ممکن است، که بر تجزیه و تحلیل تأثیر می گذارد، به ویژه در مواردی که رویکرد اسیدی فورستر در نظر گرفته می شود. علاوه بر این، تریپتوفان یک اسید آمینه نسبتا کمیاب است. بسیاری از پروتئین ها حاوی تنها یک یا چند باقیمانده تریپتوفان هستند. بنابراین، فلورسانس تریپتوفان می تواند اندازه گیری بسیار حساسی از وضعیت ساختاری باقی مانده های تریپتوفان فردی باشد. مزیت در مقایسه با پروب های بیرونی این است که خود پروتئین تغییر نمی کند. استفاده از فلورسانس ذاتی برای مطالعه ترکیب پروتئین در عمل به مواردی با تعداد کمی (یا شاید تنها یک) باقیمانده تریپتوفان محدود می شود، زیرا هر یک محیط محلی متفاوتی را تجربه می کند که باعث ایجاد طیف های انتشار متفاوتی می شود.

تریپتوفان یک فلورسنت ذاتی مهم (اسید آمینه) است که می تواند برای تخمین ماهیت ریزمحیط تریپتوفان استفاده شود. هنگام انجام آزمایش‌هایی با دناتورانت‌ها، سورفکتانت‌ها یا سایر مولکول‌های آمفی‌فیلیک، ریزمحیط تریپتوفان ممکن است تغییر کند. به عنوان مثال، اگر پروتئینی حاوی یک تریپتوفان در هسته «آب گریز» خود با افزایش دما دناتوره شود، یک طیف انتشار به رنگ قرمز ظاهر می شود. این به دلیل قرار گرفتن تریپتوفان در یک محیط آبی در مقابل یک پروتئین داخلی آبگریز است. در مقابل، افزودن یک سورفکتانت به پروتئینی که حاوی تریپتوفان است که در معرض حلال آبی قرار دارد، در صورتی که تریپتوفان در وزیکول یا میسل سورفکتانت جاسازی شود، باعث ایجاد طیف انتشار آبی می شود.^[۸] پروتئین هایی که فاقد تریپتوفان هستند ممکن است با یک فلوروفور جفت شوند.

با تحریک فلورسانس در 295 نانومتر، طیف انتشار تریپتوفان بر فلورسانس ضعیف‌تر تیروزین و فنیل آلانین غالب است.

کاربردها[ویرایش]

از طیف‌سنجی فلورسانس، از جمله در زمینه‌های تحقیقاتی بیوشیمیایی، پزشکی و شیمیایی برای تجزیه و تحلیل ترکیبات آلی استفاده می‌شود. همچنین گزارشی از استفاده از آن در افتراق تومورهای بدخیم پوست از خوش خیم گزارش شده است.

تکنیک‌های طیف‌سنجی فلورسانس اتمی (AFS) در انواع دیگر آنالیز/اندازه‌گیری ترکیب موجود در هوا یا آب، یا سایر رسانه‌ها، مانند CVAFS که برای تشخیص فلزات سنگین مانند جیوه استفاده می‌شود، مفید است.

فلورسانس همچنین می تواند برای تغییر مسیر فوتون ها استفاده شود، به کلکتور خورشیدی فلورسنت مراجعه کنید.

علاوه بر این، طیف‌سنجی فلورسانس را می‌توان با استفاده از میکروفلورمتری با سطح میکروسکوپی تطبیق داد.

در شیمی تجزیه از آشکارسازهای فلورسانس با HPLC استفاده می شود.

در زمینه تحقیقات آب می توان از طیف سنجی فلورسانس برای پایش کیفیت آب با شناسایی آلاینده های آلی استفاده کرد.^[۹]. پیشرفت‌های اخیر در علم کامپیوتر و یادگیری ماشین حتی امکان تشخیص آلودگی باکتریایی آب را فراهم کرده است^[۱۰]

References[ویرایش]

↑ Rendell, D. (1987). Fluorescence and Phosphorescence. Crown
↑ Eisinger, Josef; Flores, Jorge (1979). "Front-face fluorometry of liquid samples". Analytical Biochemistry. 94 (1): 15–21. doi:10.1016/0003-2697(79)90783-8. ISSN 0003-2697. PMID 464277.
↑ Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21 May 1999). Introduction to Fluorescence Spectroscopy. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.
↑ Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Ceresa, Luca; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Szabelski, Mariusz; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2020-06-01). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence Part I: primary inner filter effect-the proper approach for sample absorbance correction". Methods and Applications in Fluorescence. 8 (3): 033002. doi:10.1088/2050-6120/ab947c. ISSN 2050-6120.
↑ Ceresa, Luca; Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2021-05-24). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence. Part II: secondary inner filter effect -the proper use of front-face configuration for highly absorbing and scattering samples". Methods and Applications in Fluorescence. 9 (3): 035005. doi:10.1088/2050-6120/ac0243. ISSN 2050-6120.
↑ Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21 May 1999). Introduction to Fluorescence Spectroscopy. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.
↑ Lakowicz, J. R. (1999). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic / Plenum Publishers
↑ Caputo GA, London E. Cumulative effects of amino acid substitutions and hydrophobic mismatch upon the transmembrane stability and conformation of hydrophobic alpha-helices. Biochemistry. 2003 Mar 25;42(11):3275-85.
↑ Carstea, Elfrida M.; Bridgeman, John; Baker, Andy; Reynolds, Darren M. (2016-05-15). "Fluorescence spectroscopy for wastewater monitoring: A review". Water Research (به انگلیسی). 95: 205–219. doi:10.1016/j.watres.2016.03.021. ISSN 0043-1354. PMID 26999254.
↑ Nakar, Amir; Schmilovitch, Ze’ev; Vaizel-Ohayon, Dalit; Kroupitski, Yulia; Borisover, Mikhail; Sela (Saldinger), Shlomo (2020-02-01). "Quantification of bacteria in water using PLS analysis of emission spectra of fluorescence and excitation-emission matrices". Water Research (به انگلیسی). 169: 115197. doi:10.1016/j.watres.2019.115197. ISSN 0043-1354. PMID 31670087.

External links[ویرایش]

Fluorophores.org, the database of fluorescent dyes
OpenFluor, Community tools supporting chemometric analysis of organic matter fluorescence
Database of fluorescent minerals with pictures, activators and spectra (fluomin.org)

[1] Rendell, D. (1987). Fluorescence and Phosphorescence. Crown

[front-face2-2] Eisinger, Josef; Flores, Jorge (1979). "Front-face fluorometry of liquid samples". Analytical Biochemistry. 94 (1): 15–21. doi:10.1016/0003-2697(79)90783-8. ISSN 0003-2697. PMID 464277.

[Sharma,_A_19992-3] Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21 May 1999). Introduction to Fluorescence Spectroscopy. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.

[4] Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Ceresa, Luca; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Szabelski, Mariusz; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2020-06-01). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence Part I: primary inner filter effect-the proper approach for sample absorbance correction". Methods and Applications in Fluorescence. 8 (3): 033002. doi:10.1088/2050-6120/ab947c. ISSN 2050-6120.

[5] Ceresa, Luca; Kimball, Joseph; Chavez, Jose; Kitchner, Emma; Nurekeyev, Zhangatay; Doan, Hung; Borejdo, Julian; Gryczynski, Ignacy; Gryczynski, Zygmunt (2021-05-24). "On the origin and correction for inner filter effects in fluorescence. Part II: secondary inner filter effect -the proper use of front-face configuration for highly absorbing and scattering samples". Methods and Applications in Fluorescence. 9 (3): 035005. doi:10.1088/2050-6120/ac0243. ISSN 2050-6120.

[Sharma,_A_19993-6] Ashutosh Sharma; Stephen G. Schulman (21 May 1999). Introduction to Fluorescence Spectroscopy. Wiley. ISBN 978-0-471-11098-9.

[7] Lakowicz, J. R. (1999). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Kluwer Academic / Plenum Publishers

[8] Caputo GA, London E. Cumulative effects of amino acid substitutions and hydrophobic mismatch upon the transmembrane stability and conformation of hydrophobic alpha-helices. Biochemistry. 2003 Mar 25;42(11):3275-85.

[9] Carstea, Elfrida M.; Bridgeman, John; Baker, Andy; Reynolds, Darren M. (2016-05-15). "Fluorescence spectroscopy for wastewater monitoring: A review". Water Research (به انگلیسی). 95: 205–219. doi:10.1016/j.watres.2016.03.021. ISSN 0043-1354. PMID 26999254.

[10] Nakar, Amir; Schmilovitch, Ze’ev; Vaizel-Ohayon, Dalit; Kroupitski, Yulia; Borisover, Mikhail; Sela (Saldinger), Shlomo (2020-02-01). "Quantification of bacteria in water using PLS analysis of emission spectra of fluorescence and excitation-emission matrices". Water Research (به انگلیسی). 169: 115197. doi:10.1016/j.watres.2019.115197. ISSN 0043-1354. PMID 31670087.

[۱]

[۲]

[۳]

[۴]

[۵]

[۶]

[۷]

[۸]

[۹]

[۱۰]